1986: STANLEY COHEN e LEVI-MONTALCINI

Artigo científico escrito por:
Amilton Gelain, 
Graciele Deliberali
Peterson Lodi.
Faculdade de Medicina UPF

RESUMO
Trata o presente trabalho a respeito dos pesquisadores que auxiliaram, por meio de suas descobertas, o enriquecimento dos conhecimentos da área médica. Dentre os vários estudiosos, este estudo aborda os pesquisadores Stanley Cohen, um renomado bioquímico americano, e Rita Levi-Montalcini, uma especialista em neurobiologia e psiquiatria, que ganharam, no ano de 1986, o Premio Nobel de Fisiologia ou Medicina, por terem descoberto o fator de crescimento do tecido nervoso (NGF) e o fator de crescimento epidermal (EGF), estudos que demonstram como o crescimento e a diferenciação de uma célula são regulados. Abordar-se-á, também, as contribuições que suas pesquisas tiveram, como o auxilio no desenvolvimento de novas terapias para melhorar o prognóstico em várias doenças clínicas. Restringir-se-á a presente obra acerca da análise da biografia dos citados pesquisadores, a maneira com que conduziram os estudos que os levaram a serem agraciados com o Premio Nobel, bem como com as demais contribuições feitas por eles para a área médica.
Palavras-chave: Stanley Cohen, Rita Levi-Montalcini, Prêmio Nobel, NGF e EGF.

ABSTRACT

The present study speaks of the searchers that contributed with their discoveries for enrichment of understanding in medical area. Among different searchers, this study accosts a famous American biochemistry called Stanley Cohen, and a specialist in neurobiology and psychiatry called Rita Levi-Montalcini, both, winners of the Nobel Prize in 1986 in Physiology or Medicine because they discovered the neural growth factor (NGF) and epidermal growth factor(EGF), which demonstrate how the growth and differentiation of a cell is regulated. It also accosts the contributions of their researches, to help in development of new therapies, to improve the prognostic of any clinical disease. However, this study is restricted in the analysis of the biography of mentioned searchers, the mode that they led these researches, and their contributions to medical area.
Key-words: Stanley Cohen, Rita Levi-Montalcini, Nobel Prize, NGF e EGF.
 

INTRODUÇÃO

Considerando as constantes evoluções que ocorreram no campo da medicina durante o passar dos anos, é importante analisar as contribuições que as pessoas que receberam o Premio Nobel fizeram para o enriquecimento da ciência médica.
Nesta senda, a presente obra procurará fazer uma análise acerca da vida e obra de Stanley Cohen e Rita Levi-Montalcini, assim como do estudo por eles realizado para que descobrissem os fatores do crescimento das células e órgãos, pesquisa com a qual foram agraciados com o Premio Nobel em 1986.
O objetivo primordial deste estudo é mostrar um pouco da obra de Stanley Cohen e Rita Levi-Montalcini que contribuiu relevantemente para a comunidade médica e científica, além de demonstrar que a pesquisa científica é necessária para que novas descobertas aconteçam e que tais revelações podem trazer progresso e melhor qualidade de vida para a humanidade. 
Ressalte-se que o presente estudo será realizado com base em obras relacionadas com o tema, dentre as quais se pode citar as consultas em acervos disponibilizados na Internet pela Fundação Alfred Nobel – administradora do Prêmio Nobel, tudo na forma que prescreve o método dedutivo de aprendizagem.

DESENVOLVIMENTO

Stanley Cohen
Foi um bioquímico americano, nascido no Brooklyn, New York, professor da Vanderbilt University School of Medicine, Nashville, EUA, premiado internacionalmente com o Nobel de Medicina ou Fisiologia. Formado nos colégios Brooklyn e Oberlin e na Universidade de Michigan, descobriu os Fatores de Crescimento Epidermal (EGF) e Fator de crescimento do nervo (NGF) além de, juntamente, com Herbert W. Boyer, outro bioquímico norte-americano, criou uma técnica para introduzir um gene estranho no DNA de uma bactéria (1973) e, assim, deu início à era dos organismos manipulados geneticamente. Cohen deu origem à engenharia genética, ao demonstrar que, quando o DNA é rompido, seus fragmentos se recombinam em novos genes, que podem ser inseridos em células de bactérias, onde também se reproduzem sempre que as células se dividem.
Rita Levi-Montalcini
Foi uma neurobiologista italiana do Instituto de Biologia da Célula do Conselho Nacional de Pesquisa Romano, nascida em Turim, Itália, e naturalizada estadunidense, pesquisadora em fatores do crescimento e que ganhou o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina (1986) pelas descobertas sobre os fatores de crescimento, estudos esses iniciados (1952) com culturas de células de tumores em ratos, juntamente com Stanley Cohen. Filha do engenheiro eletricista e matemático Adamo Levi e da pintora Adele Montalcini, graduou-se em medicina (1936). Proibida por decreto de Mussolini de exercer a medicina na Itália por não ser de descendência  italiana ou ariana, partiu pra Bruxelas, mas voltou para Turim com a invasão alemã (1940). Como médica praticante, resistiu à ocupação alemã escondendo-se em Florença e ajudando os refugiados de guerra (1943-1945). Lecionou na Universidade de Turim (1945-1947), quando então foi para os Estados Unidos para trabalhar na Universidade de Washington, em St. Louis (1947-1977). Dividiu seu tempo entre os EUA e o Conselho de Pesquisa Nacional em Roma (1961-1989), quando então se mudou definitivamente para Roma para morar com sua irmã gêmea (1989).
O prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina é recompensado por descobertas que são de fundamental importância para o nosso entendimento sobre os mecanismos que regulam o crescimento das células e do organismo. O modelo do crescimento celular já é conhecido, mas é o desenvolvimento da bióloga Italiana Rita Levi-Montalcini e do Bioquímico americano Stanley Cohen, com suas descobertas do Fator de Crescimento dos Nervos (NGF), e do Fator de Crescimento da Epiderme (EGF), respectivamente, que poderiam mostrar como o crescimento e diferenciação de uma célula é regulado. NGF e EGF foram as primeiras de muitas substâncias reguladoras do crescimento a serem descobertas e caracterizadas.
O descobrimento do EGF e NGF tem aberto muitos campos importantes difundidos na ciência básica. Como conseqüência direta podemos acrescentar nosso entendimento sobre muitas doenças, como a malformação no desenvolvimento, mudanças degenerativas na demência senil, cura tardia de ferimentos e doenças tumorais. A caracterização destes fatores de crescimento tem ajudado no desenvolvimento de novos agentes terapêuticos e melhores tratamentos em várias doenças clínicas.
A regulação do crescimento:
Os homens adultos possuem bilhões de células. Contudo, eles começam de uma única célula que contém o código genético de um indivíduo completo. A primeira célula se divide no começo dando origem a células filhas idênticas. Em breve, porém, as células começam a exibir diferenças sutis nas características. Esta especialidade única da célula é chamada diferenciação. O padrão de crescimento e diferenciação tem sido longamente estabelecido, mas a regulação de seu desenvolvimento tem permanecido desconhecida. Foi somente depois de 2 ou 3 décadas do descobrimento dos fatores de crescimento que nosso conhecimento sobre os fatores e diferenciação das células tem começado a ficar mais claro.
Hoje sabemos que as células se comunicam umas com as outras por meio de substâncias sinais, os hormônios. Inicialmente se acreditava que os hormônios eram produzidos somente em glândulas especializadas, como a pituitária, de onde hormônios como o do crescimento eram liberados na corrente sangüínea. E tem se tornado claro que muitos tipos de células sintetizam substâncias sinais ou hormônios que têm seus efeitos tanto nas células de origem como nas células vizinhas. Por este mecanismo, as células podem influenciar no crescimento de suas vizinhas.
Os cientistas de 1940 e 1950 já sabiam que com a adição de sangue ou extratos orgânicos as células em cultura resultavam em seu crescimento com sucesso. Eles não sabiam, contudo, a identidade das substâncias ativas, assim como os pesquisadores do câncer entendiam pouco sobre o crescimento desregulado das células tumorais.
O descobrimento do NGF:
O descobrimento do fator de crescimento de nervos (NGF), no começo dos anos 50, é um exemplo fascinante de como um observador habilitado pode criar um conceito de um aparente caos. Até este tempo, pesquisadores em neurobiologia não entendiam como o desenvolvimento do sistema nervoso era regulado para resultar na completa inervação final do corpo. A investigação do papel do NGF no desenvolvimento do sistema nervoso, tanto quanto, na função neural adulta, teve uma dedicação vitalícia de Rita Levi-Montalcini. A bióloga de desenvolvimento, que no começo dos anos 50 se deslocou de sua terra natal, Itália, para o Laboratório de Viktor Hamburger em St Louis, EUA, mostrou em 1952 que quando tumores de ratos eram transplantados para embriões de pintos, eles induziam um crescimento potente do sistema nervoso embrionário dos pintos, especificamente de nervos sensoriais e simpáticos. Já que este crescimento acentuado não requeria contato direto entre o tumor e o embrião do pinto, Rita Levi-Montalcini concluiu que o tumor liberava um fator promotor de crescimento, que tinha ação seletiva em certos tipos de nervos. Seguindo esta descoberta, ela fez um sistema de cultura de células mais sensível de modo a mensurar a atividade do NGF em vários extratos. E ele provou ser uma substância biológica extremamente potente. Uma célula nervosa sensorial ou simpática reagia em 30 segundos à adição de quantidades mínimas de NGF. Uma bilionésima parte de um grama de NGF por ml de meio de cultura exercia um potente efeito de promoção do crescimento. Poucos minutos depois da adição de NGF, fibras nervosas começavam a crescer no gânglio, que depois de dias exposto ao fator assemelhava-se a um sol rodeado de raios (Figura 1). Este ensaio biológico para detectar o fator de crescimento do nervo pavimentava o caminho para o próximo passo até descobrimento – identificação da substância ativa promotora de crescimento. 
O ensaio biológico clássico para a mensuração do NGF que foi desenvolvido por Rita Levi-Montalcini. Gânglios sensoriais dissecados de embriões de pintos são cultivados na presença de extrato a ser mensurado.  Crescimento da fibra nervosa de gânglios de pintos é determinada depois de 24hs. A concentração mais baixa de extrato, que causa um halo do crescimento da fibra nervosa, contém 1 unidade biológica de NGF. Isto é equivalente à concentração de aproximadamente 10 nanogramas de NGF/ml de meio de cultura (10ng = 1/100 000 de 1 mg). 
A caracterização do NGF:
Em 1953, o bioquímico Stanley Cohen, se juntou ao grupo de pesquisa de St. Louis. Três anos depois eles já tinham purificado um extrato de fator e crescimento de um nervo de um tumor de rato, que continha proteínas e ácidos nucléicos. Para determinar quais destes componentes eram ativos, Cohen adicionou veneno de cobra contendo uma alta concentração de uma enzima degradante de ácido nucléico. Para sua surpresa, o veneno da cobra continha mais atividade indutora de crescimento de nervos do que o tumor sozinho. Quando adicionado sozinho no meio de incubação, o veneno de cobra induzia um enorme crescimento das fibras nervosas simpáticas. O grupo seguiu adiante este inesperado achado por pesquisa sistemática da presença de NGF em vários tecidos. Em 1958, eles descobriram outra fonte rica em NGF – uma glândula salivar em ratos machos. Com a ajuda do veneno de cobra e extrato da glândula salivar, Stanley Cohen foi agora capaz de purificar NGF e produzir anticorpos contra este fator. Assim como NGF induzia o crescimento dos nervos, a adição de anticorpos anti NGF inibia o crescimento no meio de incubação. A estrutura química do NGF é agora conhecida por consistir de 118 aminoácidos. Duas cadeias ligadas para construir uma molécula biologicamente ativa.
Os avanços estavam a uma milha no desenvolvimento da neurobiologia. No primeiro momento, substâncias químicas sinais quimicamente definidas poderiam ser usadas na pesquisa de mecanismos que regulavam o desenvolvimento neural.
NGF é necessário para a sobrevivência de células nervosas:
NGF é encontrado em mamíferos, pássaros, répteis, anfíbios, e peixes. Muitos tipos de células destas espécies sintetizam e liberam NGF durante o desenvolvimento. O crescimento das fibras nervosas é estimulado por este mecanismo. As fibras nervosas crescem em direção a fonte de NGF, que é levado ao final da fibra e transportado de volta ao corpo das células nervosas. Alguém pode imaginar que os tecidos atraem fibras nervosas para eles enviando NGF. Um excesso de células nervosas sensoriais e simpáticas é produzido durante o desenvolvimento. Apenas aquelas, que estabelecerem contato com o órgão alvo produtor de NGF, sobrevivem. Com a tecnologia genética moderna tem-se agora sido possível caracterizar o gene do NGF em homens e animais. Técnicas de hibridização identificando o RNA mensageiro do NGF tem mapeado os tecidos que sintetizam NGF. A tecnologia genética também torna possível o NGF recombinante, que abriu caminhos para sua aplicação na medicina clínica.
A descoberta do EGF:
Durante o curso de seus estudos sobre o NGF, Stanley Cohen observou uma aceleração inesperada do desenvolvimento quando ele injetava glândula salivar extraída de camundongos recém-nascidos. Os camundongos desenvolveram pálpebras precocemente abertas e crescimento dentário. A explicação era que a glândula salivar extraída continha outro fator de crescimento além do NGF. Cohen chamou esta substância de fator de crescimento epidérmico (EGF), pois ela poderia estimular a proliferação de células epiteliais na pele e córnea. Ele aumentou os anticorpos contra o EGF, assim como ele fez para o NGF. 
Nos anos seguintes, Cohen purificou e determinou as estruturas dos aminoácidos do EGF. Por primeiro, os cientistas tinham um fator avaliável que estimulava o crescimento de células epiteliais e permitiam estudar o processo do crescimento. Cohen e seus colaboradores encontraram que o EGF aumentava uma cascata de eventos, incluindo estimulação de transporte de glicose e aminoácidos, ativação da síntese de proteínas e iniciação da síntese de DNA e replicação celular. Em estudos mais tarde, ambos Cohen e seus colaboradores têm mostrado que o EGF estimula o crescimento de uma larga variedade de células incluindo fibroblastos, células do fígado, e células vasculares tanto quanto células endócrinas, a tireóide, ovários e glândula pituitária.
 A presença de sítios específicos de ligação, chamados receptores, na superfície das células alvo era um pré-requisito para ação do EGF. Estes receptores pegavam o EGF e o complexo receptor-EGF era levado para dentro da célula. Um significado, os avanços estavam a uma milha no desenvolvimento neurobiológico. Primeiramente, substâncias-sinais quimicamente definidas poderiam ser usadas na pesquisa de mecanismos, que regulavam o desenvolvimento neural. Uma pegada conduzindo a ação biológica do EGF é a fosforilação de um aminoácido tirosina, específico no receptor EGF. O achado da autofosforilação específica da tirosina do receptor foi uma brecha em nosso entendimento de como um sinal do lado de fora pode alcançar o lado de dentro das células. E mostrou mais tarde que este evento é um caminho geral através de muitos fatores de crescimento que intermedeiam estes efeitos. 
O conhecimento da regulação do crescimento normal de células tem se munido de novas transformações dentro das células e crescimento do tumor. Estudos em certos tumores induzidos por vírus lideraram as descobertas de genes especiais, chamados oncogenes, que ligam uma parte na transformação de células. Entre estes oncogenes, há um que codifica a síntese de proteínas com homologia ao receptor EGF. Outros produtos de oncogenes mostram similaridade com um fator de crescimento descoberto mais tarde derivado de plaquetas sangüíneas (PDGF). Como freqüentemente ocorre, o aumento do conhecimento de eventos normais tem liderado uma melhor compreensão da doença.
A pesquisa por outros fatores do crescimento:
Durante a última década, uma série de fatores de crescimento têm sido isolados e caracterizados por diferentes grupos de pesquisa. Por exemplo, somatomedina ou insulina, como fatores de crescimento que mediam o efeito promotor de crescimento do hormônio de crescimento, foram isoladas do plasma humano. Fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGF) foram isolados e mostraram estimular o crescimento de células mesenquimais. A Interleucina-2 foi isolada e mostrou promover o crescimento dos linfócitos do sistema imune. Dos tumores, fatores de crescimento de células endoteliais, foram isolados e mostraram ter similaridades com o fator de crescimento de fibroblastos (FGF).
Todos os grupos de pesquisa que descobriram “novos” fatores de crescimento têm seguido a trilha de Levi-Montalcini e Cohen. Na área de pesquisa dos fatores do crescimento e suas ações biológicas, Levi-Montalcini e Cohen tem criado uma escola científica com um crescente número de seguidores.
Aplicabilidade do NGF e EGF:
O esclarecimento dos mecanismos de regulação do crescimento e sobrevivência das células tanto quanto a sua diferenciação são de grande interesse para a ciência básica. Contudo, este conhecimento pode ser usado para melhorar nosso entendimento da patogênese das desordens clínicas severas como a malformação e erros do desenvolvimento, mudanças degenerativas como ocorre na demência senil, cura de ferimentos tardia, distrofia muscular assim como doenças tumorais. 
Um importante campo da terapia com NGF é a possibilidade de aumentar o processo reparatório depois de danos aos nervos tanto no sistema nervoso periférico como no central. O achado recente de NGF no cérebro criou uma grande expectativa. Um importante caminho no cérebro com acetilcolina, substância transmissora parece ser sensível ao NGF.
Em estudos feitos com animais, o EGF se mostrou aumentando a cura de ferimentos tanto na pele como na córnea. Quantias limitadas de EGF humano tem restringido seu uso a humanos. Apenas depois que foi possível produzir EGF recombinante, eliminatórias clínicas foram iniciadas. Uma aplicação do EGF era para aumentar o reparo de ferimentos na pele e córnea como, por exemplo, aplicação local depois do dano ou cirurgia antecipada. O autotransplante de pele poderia ser melhorado se as células epiteliais pudessem ser rapidamente cultivadas fora do corpo com a ajuda do EGF. Também seria possível que, antagonistas do EGF ou anticorpos para os receptores EGF na superfície das células, pudessem ser úteis no tratamento de tumores no qual o desarranjo do EGF ou receptores EGF está envolvido na sua transformação.
Contribuições para a Atualidade:
A descoberta dos ilustres cientistas foi relevante para a ciência e ainda hoje são usadas em muitas pesquisas que partem do que já foi descoberto pelos cientistas.
Stanley Cohen mesmo antes de iniciar a pesquisa do Fator de Crescimento Epidermal (EGF), em associação com um outro bioquímico norte-americano, Herbert Boyer, deram os passos iniciais nas pesquisas com DNA-Recombinante. Eles usaram tesouras bioquímicas para retirar uma parte do material genético de uma bactéria e nele introduzir genes exógenos que seriam responsáveis pela produção de, por exemplo, uma proteína. Esse novo material genético também se reproduz sempre que as células se dividem para formar novas células. A engenharia genética nunca mais foi a mesma após essa descoberta, uma vez que isso permitiu a produção de plantas geneticamente modificadas que hoje são plantadas comercialmente em lavouras de quase todo o planeta. Outro auxílio que isso trouxe foi a produção de insulina artificialmente se baseando no princípio de que este hormônio é de origem protéica e a sua produção dá-se a partir de genes contidos no DNA. Quando se insere os genes produtores em uma cultura de bactérias, essas por sua vez produzirão insulina que é utilizada em Diabéticos para que ocorra uma melhora na qualidade de vida desses pacientes.
O Fator de Crescimento Nervoso (NGF) está sendo utilizado de forma experimental na regeneração de nervos periféricos lesados. Se estas pesquisas atingirem seus objetivos, inúmeras pessoas que sofrem dessa enfermidade terão solucionado ou ao menos amenizado o seu problema.
O EGF está sendo empregado em tratamentos de beleza para combater as tão indesejadas rugas que surgem com o passar do tempo. Nesse caso o Fator estimula a proliferação de células epiteliais que impedem a flacidez que origina as rugas. Além de tratamentos de beleza ele está sendo muito empregado no tratamento de ulcerações gástricas, esofágicas e epidérmicas.
Orientadores:
Evania Araújo
Jorge Salton