2007: MARIO CAPECCHI, MARTIN EVANS e OLIVER SMITHIES

Professor: Jorge Alberto Salton
Acadêmicas: Mariele Bressan
Sheila Cover
Silvana Motyczka Birmann

Passo Fundo, abril de 2008
2007: Mario Capecchi, Sir Martin Evans e Oliver Smithies
    
Artigo científico escrito por:  BIRMANN, Silvana M.
BRESSAN, Mariele
                                          

RESUMO
As células-tronco embrionárias têm sido alvo de grande discussão dentro e fora do campo da ciência médica. O Prêmio Nobel de 2007 foi conferido aos pesquisadores Mario Capecchi, Sir Martin Evans e Oliver Smithies por suas descobertas relacionadas à modificação de genes específicos através do uso de células-tronco embrionárias de ratos. As pesquisas chamam atenção por seu imenso potencial tecnológico que está atualmente sendo aplicado em várias áreas biomédicas, sendo possível produzir praticamente qualquer tipo de alteração no genoma das linhagens de ratos, possibilitando aos cientistas a investigação da relação de cada gene com o processo saúde-doença. 

PALAVRAS-CHAVE: células-tronco embrionárias, Mario Capecchi, Oliver Smithies, Sir Martin Evans, segmentação genética.

ABSTRACT
Embryonic Stem Cells (Es cells) has been the subject of great debate within and outside the field of medical science. The Nobel Prize in 2007 was awarded to researchers of Mario Capecchi, Sir Martin Evans and Oliver Smithies for his discoveries related to modification of specific genes through the use of embryonic stem cells in mice. Research call attention for its immense technological potential that is currently being applied in various biomedical fields, and can produce almost any type of change in the genome of  mouse strain, enabling the scientists to research the relationship of each gene with the health-disease .

KEYWORDS: embryonic stem cells, Mario Capecchi, Oliver Smithies, Sir Martin Evans, gene targeting.

INTRODUÇÃO
O presente artigo tem como finalidade relatar a vida e a obra de Mario Capecchi, Oliver Smithies e Martin Evans, cientistas ganhadores do Prêmio Nobel de Medicina ou Fisiologia no ano de 2007. Pelo segundo ano consecutivo, a premiação da área médica foi atribuída a uma descoberta na área da Genética. Os cientistas descobriram como neutralizar um gene, técnica essencial no domínio terapêutico que é reconhecida como a base da biomedicina do século XXI. Sir Martin Evans identificou, isolou e modificou as células-tronco de embriões jovens, células a partir das quais todas as células do organismo adulto são derivadas. Posteriormente, reintroduziu as células em úteros a fim de gerar um filhote geneticamente modificado. Mario Capecchi e Oliver Smithies, independentes um do outro, descobriram como a recombinação de homólogos entre segmentos de moléculas de DNA pode ser utilizada para segmentar genes no genoma de mamíferos e desenvolveram métodos para isso. Os animais geneticamente modificados tornaram-se indispensáveis para a investigação médica, e o conhecimento sobre células-tronco e biologia genética obtidos durante as pesquisas que levaram ao método knockout, mudou nossa compreensão da relação saúde-doença e criou novos caminhos para a terapêutica médica.

DESENVOVIMENTO
Célula-tronco é aquela capaz de proliferar-se criando mais células-tronco (auto-renovação), assim como descendentes celulares mais diferenciados. O embrião contém células-tronco totipotentes, ou seja, que podem se diferenciar em qualquer tipo de célula do organismo. Sendo assim, o pensamento de que as células-tronco embrionárias do blastocisto pudessem ser usadas para criar um mamífero vivo tem fascinado cientistas durante muitos anos. 

O estudo de teratomas testiculares mostrou que esses tumores contêm células totipotentes. Na década de 1950, Leroy Jackson Stevens descobriu que camundongos da classe 129Sv têm alta freqüência de tais tumores. Ele mostrou que essas células poderiam se desenvolver em agregados de células embrionárias. Quando transplantados, tais agregados poderiam induzir tumores sólidos em diversos tipos de células. Alguns anos mais tarde, Kleinsmith e Pierce demonstraram que tais tumores eram derivados de células indiferenciadas de carcinoma embrionário (células CE).
O desenvolvimento de técnicas de cultivo celular permitiu criar culturas de células de carcinoma embrionário. Vários cientistas relataram sobre essas culturas no início dos anos 70, entre eles, Martin Evans, que obteve ratos 129Sv de Stevens e caracterizou as células derivadas de teratoma. Essas células poderiam ser cultivadas e através de determinados processos se diferenciaram in vitro, originando todos os tipos de células, incluindo pele, nervos, músculo cardíaco, etc. 
Evans percebeu o potencial de uso dessas células para criar camundongos geneticamente modificados (quiméricos). Para tal feito, estabeleceu uma colaboração com Richard Gardner, de Oxford, e fizeram injeções de células de carcinoma embrionário em blastocistos e as reimplantaram nos úteros das mães. Os filhotes foram quiméricos, com presença de células CE em quase todos os tecidos. No entanto, ratos transportando essas células desenvolveram vários tumores e não poderiam contribuir para uma linhagem germinativa devido a suas anomalias cariotípicas.
Tornou-se evidente para Evans que deveria ser utilizada uma nova estratégia para se obter a transmissão germinativa das células modificadas geneticamente. Com o uso de determinados anticorpos, ele caracterizou a superfície celular de grupos de células CE normais e os seus homólogos, para assim identificar marcadores moleculares de diferenciação precoce. Os resultados sugeriram que existiam células normais com fenótipos semelhantes aos das células CE poderiam ser utilizados para experimentos. Em 1980, Evans se aliou ao embriologista Matt Kaufman para combinar a cultura celular e a manipulação de embriões. Conforme posteriormente descrito por Evans:
Quando cultivei esses blastocistos retirados de uma cultura de tecidos, utilizando um meio que tinha sido ótimo para aperfeiçoar a eficiência da clonagem tanto em rato como em células CE humanas, eu imediatamente registrei um crescimento de células como as CE. Essas células foram claramente reconhecíveis como células pluripotentes e passaram em todos os testes [...] e se diferenciaram in vitro [...] e, o mais importante, fizeram esplêndidas quimeras.
Essas células eram as células-tronco embrionárias, que se tornaram fundamentais para o êxito da segmentação genética. Evans e Kaufman publicaram seu relatório sobre essas células na revista Nature, em julho de 1981. Evans e Kaufman apontavam para a possibilidade de utilizar células-tronco embrionárias para modificação genética. Eles escreveram:
As (isto é, células-tronco embrionárias) usar como veículo para transferência de alelos mutantes para o genoma do rato, seja selecionadas em cultura ou inseridas em células por meio de transformação, com fragmentos específicos de DNA, tem sido apresentado como uma proposta atrativa. Em muitos desses estudos, a utilização de células pluripotentes diretamente isoladas do embrião em estudo deverá ter grandes vantagens.
A equipe de Evans criou técnicas de injeção no blastocisto a fim de testar se as células-tronco embrionárias poderiam contribuir para células germinativas funcionais e, por conseguinte, ser utilizadas para criar ratos quiméricos. Eles relataram transmissão germinativa bem sucedida em 1984, em outro marco no periódico Nature.
O passo seguinte foi determinar se as células-tronco embrionárias poderiam ser utilizadas para introduzir material genético na linhagem germinal. Evans e seus colegas infectaram essas células com um retrovírus recombinante antes de injetá-las em blastocistos. O DNA retroviral foi identificado nos “pais” e transmitido à descendência F1, demonstrando introdução do DNA estrangeiro na linhagem germinativa do rato. Em outubro de 1986, Evans et al relataram duas descobertas na Nature e concluíram que “cultuar células embrionárias proporciona um meio eficaz para a produção de animais transgênicos”. 
Evans deu o passo importante da introdução de um gene mutante endógeno, específico, no genoma do rato. Ele e seus colegas transferiram para um gene mutante hipoxantina fosforibosiltransferase (HPRT), que é deficiente na síndrome Lesh-Nyhan, um defeito monogênico do metabolismo da purina ligado ao X. Várias cópias do gene mutante HPRT foram introduzidas no genoma das células-tronco embrionárias por infecção retroviral. As células mutadas foram injetadas em blastocistos e contribuíram para quimeras. As mutações foram transmitidas para a linhagem. Pela primeira vez, modelos de doenças humanas tinham sido criados por manipulação genética de células. 
No final da década de 80, os doutores Oliver Smithies e Mario Capecchi estudavam, independentemente, um mecanismo para introduzir uma seqüência genética específica em um local bem preciso de um cromossomo. Essa idéia foi considerada, inicialmente, inviável. Mas, foi graças à recombinação homóloga, a qual permite troca de segmentos de DNA entre cromossomos homólogos, que a técnica tornou-se possível.
O princípio da recombinação homóloga é conhecido desde 1958. Nos anos 70, ficou evidente que eucariontes usavam esse mecanismo para mediar trocas de informações genéticas entre cromossomos homólogos durante a meiose. Essas evidências foram seguidas por experiências demonstrando recombinação entre seqüências de DNA retroviral no genoma de mamíferos com introdução de DNA oligomérico.
A aplicabilidade da recombinação no estudo ganhador do Prêmio Nobel teve contribuição dos três laureados:
Mario Capecchi usou o método injetando DNA diretamente no núcleo das células.Com isso, melhorou a eficiência da transferência, mas o gene transferido ainda era introduzido aleatoriamente no genoma hospedeiro. Através de estudos com genes defeituosos de resistência à neomicina, ele melhorou a técnica e constatou que, de fato, a recombinação homóloga poderia ser usada para manipular genes de mamíferos.
Na mesma época, Smithies também estava trabalhando com a recombinação homóloga a fim de reparar genes mutantes. Eles tomaram conhecimento das células tronco embrionárias de Martin Evans e os três começaram o cultivo de Células ES para uso em experimentos de recombinação homóloga. As experiências demonstraram que modificações genéticas em tais células podem ser transmitidas às germinativas e registradas na descendência. Assim, o ano de 1989 assistiu ao nascimento de vários camundongos criados a partir do “knockout”. 
O trabalho dos três cientistas sobre a segmentação genética e criação de ratos transgênicos abriu um novo horizonte para as pesquisas de doenças como o Alzheimer e o câncer. 
Smithies utilizou a técnica da segmentação em pesquisas sobre fibrose cística e talassemia, também desenvolveu ratos como modelos para hipertensão e arteriosclerose. Com a técnica de nocaute, tornou-se possível alterar o funcionamento de praticamente qualquer gene desde os primeiros estágios embrionários dos animais de laboratório, principalmente camundongos, cuja fisiologia é uma boa aproximação da humana. Os novos animais que nascem podem, então, ser acompanhados ao longo da vida, ajudando os pesquisadores a entender de forma precisa o efeito de cada gene na saúde e no desenvolvimento dos seres vivos.
A primeira zona a que a genética experimental  virou a sua atenção após o nascimento da segmentação genética em mamíferos foi a das doenças monogênicas. A síndrome de Lesh-Nyhan, um defeito no metabolismo de nucleotídeos causado por uma mutação no gene HPRT, na verdade, serviu como a condição modelo durante o desenvolvimento da tecnologia, tanto nos laboratórios de Evans e Smithies. Uma das razões para esta escolha desta determinada condição médica foi porque condições de seleção para isolar células transduzidas estavam disponíveis para HPRT.
Administração de um inibidor APRT do HPRT, induziu camundongos a um comportamento persistente auto-prejudicial semelhante ao quadro clínico de doença humana. Este é um exemplo da necessidade de análise sofisticada de funções integradoras quando caracterizam o fenótipo de camundongos com genes segmentados.
A fibrose cística é uma das doenças monogênicas mais comuns e foi escolhida para estudos de gene - segmentação por Smithies e os seus co-trabalhadores [53, 54]. O gene defeituoso foi identificado por estudos  articulados entre famílias doentes seguido de clonagem molecular. Ela acabou por se revelar um canal clorídrico AMPc-ativado e foi denominado de fibrose cística regulador da condução transmembrana (CFTR). Ao tirar fora CFTR nos ratos, foi gerada uma condição que reproduziu muitas características da doença humana. Estes estudos estavam entre os primeiros a criar um modelo de uma doença humana por gene segmentação em ratinhos.Eles foram seguidos por uma avalanche de tais modelos knock-out. A própria patogênese da doença cardíaca hereditária foi explorada com sucesso pelas abordagens da segmentação de genes. 
Doenças complexas que envolvem a ação de mais de um gene, e, além disso, interações ambientais dos genes representam um desafio especial para a investigação médica. Herança, penetração e interações são geralmente mal entendidas, foi difícil para dissecar o contributo individual de um fator genético, bem como a distinção entre causa e correlação tem sido problemática. Para provar causalidade, de tal sistema complexo, experiências devem permitir a detecção dos efeitos da mudança  de apenas uma única variável de uma só vez. A segmentação genética fez tais experimentos possíveis e permitiu a compreensão de causa em doenças complexas. Oliver Smithies foi o líder nesse desenvolvimento. Juntamente com Nobuyo Maeda, ele incidiu sobre duas importantes doenças complexas hipertensão e aterosclerose. Estudos sugerem que fatores genéticos podem contribuir para aproximadamente 70% da agregação familiar da hipertensão essencial. No entanto, pelo menos 10 genes foram mostrados a alterar a pressão arterial e os seus produtos genéticos aparecem para interagir em formas complexas.
Smithies suspeitou que efeitos da dosagem dos genes tivessem impacto sobre níveis de pressão arterial e concebeu um novo método de titulação dosagem gene, produzindo ratos com um, dois ou três cópias funcionais da AGT gene.  Segmentação "convencional" foi utilizada para produzir a um e duas cópias nos ratinhos e reparação gap segmentação genética para produzir camundongos com três cópias do gene AGT. Isto resultou em proporcionalmente mais elevados níveis de produtos de gene (ou seja, proteínas angiotensinogênio plasmáticas) e, mais importantes, proporcionalmente mais elevados da pressão arterial com o aumento do número gene cópia. Dosagem gênica, expressão gênica, e gene produto apuramento/ catabolismo todos devem ser considerados quando se avalia a genética regulação da pressão arterial.
Em 1992, Nobuyo Maeda, trabalhando no departamento de Smithies na Universidade da Carolina do Norte, desenvolveu um modelo de aterosclerose em ratos visando o gene para apolipoproteína E (Apoe). O mesmo gene foi direcionado independentemente pelos investigadores no Rockefeller University. O Apoe do rato desenvolve espontânea aterosclerose, que é notavelmente similar à doença humana. Pelo cruzamento com outros ratinhos com genes segmentados, não foi possível deduzir a importância dos genes que regulam a inflamação, metabolismo lipídico, pressão arterial e outros fatores a serem propostos envolvidos na doença cardiovascular aterosclerótica. A segmentação gênica tem sido excepcionalmente útil também na investigação oncológica. Um grande número de proto, genes supressores tumorais, e fatores angiogenéticos foram segmentados em diferentes tecidos de ratinhos para lançar luz sobre a indução e disseminação de tumores. A segmentação de genes de fatores de crescimento endotelial e enzimas proteolíticas têm sido essenciais para a compreensão dos mecanismos de neoangiogêneses e metástases de tumores sólidos e também são utilizados para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para evitar a propagação.
A pesquisa contemporânea em maioria, se não toda sobre as principais doenças humanas envolve gene segmentação em ratinhos e existem "modelos knockout" para endócrinas, metabólicas, neurológicas, e outras desordens inflamatórias. Modelos de ratos gene - segmentados também têm uma importância cada vez maior em estudos de defesa contra agentes patogênicos. Na verdade, ratinhos gen-segmentados tornaram-se indispensáveis em praticamente todos os aspectos da investigação médica.

BIOGRAFIAS
MARTIN EVANS
Sir Martin Evans nasceu na cidade de Stroud (ING), no dia 01 de janeiro de 1941. Formou-se em Bioquímica na Universidade de Cambridge em 1963. Após graduar-se, ele decidiu dedicar-se ao estudo do controle genético no desenvolvimento de vertebrados. Sua pesquisa PhD precoce (diplomado em 1969 pelo University College de Londres) permitiu-lhe explorar o uso de células-tronco com teratocarcinomas de ratos em culturas de tecidos. Ele foi o primeiro a manter essas células em cultura sob condições onde sua habilidade de diferenciação pôde ser observada.

Após seu retorno para Cambridge, por volta de 1981, ele estava apto a isolar células de embriões normais. Ele e seus colegas demonstraram que aquelas células, conhecidas por “embryonic stem cells” ou células-tronco embrionárias, estavam aptas a serem utilizadas para regeneração completa de ratos reprodutores férteis das células da cultura e que esses poderiam, portanto, carregar mutações introduzidas e selecionadas ou triadas para a cultura. Esta é agora a base do “knockout” em ratos e da manipulação de segmentação genética. Desde então, Sir Martin, que foi para a Escola de Biociências da Universidade de Cadiff em 1999, tem explorado os métodos “knockout mice” e “gene trap”, ambos para descoberta e criação de modelos animais de doenças humanas.
Sir Martin já publicou mais de 120 artigos científicos. Ele foi eleito como Fellow da Sociedade Real em 1993 e é fundador dos Fellow da Academia de Ciências Médicas. Em 1993, ele foi premiado com o Walter Cottman Fellowship e o William Bate Hardy. Também foi premiado com o prestigioso Albert Lasker por pesquisa de medicina básica nos EUA em 2001. Em 2002, ele foi premiado com doutorado honorário da Escola de Medicina Mount Sinai em Nova Iorque, reconhecido como um dos maiores centros de treinamento em medicina e ciência do mundo.
OLIVER SMITHIES
Dr. Oliver Smithies nasceu em 23 de Julho de 1925 em Halifax, West Yorkshire, Inglaterra. Freqüentou uma grande escola para os alunos considerados excelentes e ganhou uma bolsa na Universidade de Oxford. Formou-se em fisiologia na Universidade de Oxford em 1946, mesma universidade onde obteve o doutorado em bioquímica no ano de 1951. 
Em 1951, transferiu-se para a Universidade de Wisconsin, em Madison (EUA).
Entre 1953 e 60, trabalhou no Laboratório de Pesquisas Médicas Connaught, da Universidade de Toronto (Canadá) onde melhorou a técnica da eletroforese em gel, utilizada para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA, a qual envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de potencial. Depois voltou a Wisconsin, onde lecionou Genética.
Em meados da década de 1980, enquanto na Universidade de Wisconsin, Smithies co-descobriu uma técnica para introduzir material DNA nas células, reproduzido um processo natural chamado DNA recombinação homóloga. Ele pensava que doenças genéticas poderiam ser tratadas corrigindo mutações em células da medula óssea ou de células estaminais. Esta "gene segmentação" levou à criação de ratinhos transgênicos, que repetem doenças humanas. Em seu laboratório, produziu o primeiro modelo animal de fibrose cística, e também estudou a pressão arterial elevada, aterosclerose e outras doenças.
Este método também permitiu aos cientistas estudarem genes específicos, criando "knockout mice". Agora este método é usual na investigação biomédica e tem sido a base para milhares de artigos publicados. 
De acordo com o comitê Nobel, a segmentação genética em ratinhos perpassou todos os domínios da biomedicina. O seu impacto sobre o entendimento da função genética e os seus benefícios para a humanidade continuarão a aumentar ao longo de muitos anos vindouros. 
Atualmente, Dr. Oliver Smithies é Excellence Professor de patologia no laboratório da Escola de Medicina da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill, onde seus interesses de investigação incluem a construção de modelos animais de doenças genéticas humanas complexas para ajudar a desenvolver novos modos de tratamento, incluindo a terapia genética. É o primeiro professor pleno da Universidade a receber um Prêmio Nobel. 
MARIO CAPECCHI
Nasceu em Verona, Itália, em 1937.  Recebeu seu Bacharelado em química e física de Antioch College em 1961, e seu Ph.D.  Licenciado em biofísica Universidade de Harvard em 1967.  De 1967-69, Dr. Capecchi foi um Junior Fellow da Sociedade de bolsistas na Universidade de Harvard.  Em 1969 tornou-se Professor Auxiliar no Departamento de Bioquímica, Harvard School of Medicine.  Ele foi promovido a Professor Associado em 1971.  Em 1973, começou a trabalhar na faculdade da Universidade de Utah como um professor de Biologia. Desde 1988 o Dr. Capecchi foi um investigador do Instituto Médico Howard Hughes, desde 1989, Professor de Genética Humana da Universidade de Utah School of Medicine, e desde 1993, Ilustre Professor de Genética Humana e Biologia.  
Ele é também co-presidente do Departamento de Genética Humana. 
Sua tese trabalhos, sob a orientação do Dr. James D. Watson, incluiu a análise dos mecanismos de repressão disparate; o início de síntese protéica, incluindo a demonstração de como o Formylmethionine tRNA é iniciador de síntese protéica, e os mecanismos de proteína rescisão .
É conhecido pelo seu trabalho pioneiro sobre genes embrionários em ratos. Esta tecnologia permitiu que os cientistas pudessem criar ratos com mutações em qualquer gene e, assim, manipular diversas seqüências do DNA destes animais. Os conhecimentos obtidos com a investigação possibilitaram avanços em diversas doenças genéticas de mamíferos, especialmente no campo neurológico.

CONCLUSÃO
A segmentação genética tem transformado fisiologia e medicina. A capacidade de gerar projetos de previsíveis mutações nos genes de ratos levou a penetrar em novas introspecções sobre desenvolvimento, imunologia, neurobiologia, fisiologia e metabolismo. Como também, permitiu a geração de modelos patológicos humanos em um tratável sistema em mamíferos e, conseqüentemente, a experimental dissecação dos estágios de doenças. Finalmente, o desenvolvimento de novas terapias para corrigir defeitos genéticos no homem terá como base a experiência de modificação genética que se baseia nas descobertas feitas por Mario Capecchi, Martin Evans e Oliver Smithies.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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http://pmsalves.wordpress.com/2007/10/08/nobel-da-medicina-atribuido-aos-pais-do-ratinho-knock-out-e-do-knock-in/
http://www.fieo.br/v1/acervo/download/normas_trabalhos_academicos.pdf